海军次官丰田真次郎主持会议，海军省军务局长阿部胜雄少将首先介绍说明了有关缔结三国同盟的经过。海军大臣及川接着就对自己同意三国同盟作了辩解，说：如果海军再继续反对三国同盟，近卫内阁只有总辞职。对海军来说，实在负担不起导致内阁垮台的责任，所以不得不同意缔结同盟条约。他强调说："我希望诸位最好表示赞成。"
随后军令部总长伏见宫博恭亲王为了给会议确定基调，首先发言附和及川海相的观点："事情到了这个地步也是没有办法的。"他刚说完，老资格的海军大将大角岑生便代表军事参议官表态；"作为军事参议官我们赞成。"既然海军资深人物都如此表态，其后再也没有人敢于发表意见，会议冷场。正在这时，山本五十六站了起来；
"我绝对服从海军大臣，所以对大臣的处置绝无异议。只是有一件令人担心的事想请教你。8个月前，我任次官的时候，按照政府的物资动员计划，其中80％是仰赖英美势力范围以内的物资供应。然而在缔结了三国同盟后的今天，势必失去这一来源。为了弥补不足要如何改变物资动员计划呢？对于这一点我希望得到明确的答覆，以便能安心执行联合舰队司令长官的职务。"
可是，及川海相召开此会的目的，不是来听取意见的，而是要强行通过。因此他没有正面回答山本的问题，只是说："虽然大家都有看法和意见，但事已如此，还是恳请各位能表示赞成的意见。"这是多么荒唐可笑。会议就这样收场了。
对这一决定的利害有清醒认识的山本五十六，以其"武士"特有的"忠诚"，在与自己意见不合的情况下，再次服从了政府的意旨。散会之后，首相近卫文磨亲自接见了山本，听取他的意见。近卫问他，如果日美开战，海军的看法如何？
山本回答说："如果非打不可的话，在开始的半年或一年中，可以奋战一番，并有信心争取打胜。如果战争持续下去，以至拖上二三年，那我就毫无把握了。三国同盟条约已经缔结，只有破釜沉舟背水一战了。儘管如此，我还是希望政府能设法迴避同美国交战。"
据说，山本憋了一肚子气回到联合舰队的旗舰"长门"号上。这一次他又成了一个被利用的工具。不仅如此，在和美国为敌已成定论的形势下，作为联合舰队司令的山本不得不反覆地思考，一旦日美开战，如何去打赢这一仗。他本来就认为日本不可能战胜美国，即使取得一定胜利然后求和也不可能，如要达到目的，显然只有采取特殊的方法来求得出路、此时已经做了过河卒子的山本，只有拼命向前了。山本隐约中感到自己似乎註定要扮演这种悲剧角色。但不管怎么说，由于山本比那些被他称为"马粪"、"禽兽"的军部头子具有更多的知识和才能，他在尔后的侵略战争中所起的作用也就比他所憎恨的那些人更加恶劣、更加危险。
就在及川海军大臣虚伪地就三国同盟问题在海军内征求意见时，内阁已着手进行与德国的谈判了。1940年9月7日，松冈外相邀请的德国特使海因里·斯塔玛到达东京，就签订三国同盟条约进行谈判。9月10日，松冈费尽心机，掺杂着无数谎言和诺言达成了与德国的协议。9月27日，松冈外相带着他的微笑参加了在柏林帝国总理府举行的盛大签字仪式。这一条约规定："日本国承认并尊重德意志国和义大利国在欧洲建设新秩序的领导地位；德意志国和义大利国承认并尊重日本在大东亚建设新秩序的领导地位。日本国、德意志国和义大利国约定，对上述方针所作的努力，互相协助。并且进一步约定，三缔约国中任何一国遭到现在尚未参加欧洲战争及日华纠纷的一国攻击时，三国须用所有政治、经济和军事手段相互援助。"其矛头直指美国。
三国同盟紧锣密鼓，日本业已开始南进。9月23日，日军分三路开进了印度支那北部，迈出了南进的第一步。
美国将日本与德国缔结同盟条约视为对其利益的直接威胁，同时更无法容忍日本南下印度支那。因此，三国同盟条约的签订和日军进驻法属印度支那北部，使日美矛盾骤然加剧。1940年9月，美国宣布禁止向日本出口废钢铁，并实施美国石油输往日本需凭许可证的制度，勒紧了美国国务卿赫尔所说的"手中的缰绳"。
局势已经无可挽回。对日本的前途引以为忧的山本，在三国同盟条约签订后不久，在同他的间谍秘书原田一起进餐时，忧郁地说道："在我看来，我们要同美国打仗，就必须作好几乎向全世界挑战的准备……。我将竭尽我的全部力量，但是我希望战死在我的旗舰'长门号'的甲板上。在那些不祥的日子里，你将至少3次看到东京被夷为平地。其结果将是延长人民的痛苦。而你和近卫，还有其他人，也许会被人民群众千刀万剐，儘管想起这种情景是很遗憾的，局势确实令人困惑。我们已经陷入这种困境，命运註定在劫难逃。"
既然日本早已使自身走向一条既定的道路，山本也没有多少选择的余地。更何况山本本人毫无疑问也是一名深入骨髓的军国主义者。他的好战心理源于他根深蒂固的武士道传统，他像当时大多数的日本人一样，相信只有日本人才完全符合逻辑地充当亚洲国家的"救世主"，将亚洲从白种人的统治之下解放出来。